1898年(光绪二十四年)春,他和康有为、梁启超等加强了联系,参加领导了保国会和戊戌维新变法运动。此时维新派与顽固守旧势力之间进行了激烈的纷争。但不掌实权和生性懦弱的光绪优柔寡断,迟迟没有决定。
1898年4月13日,杨深秀上书光绪帝指出:维新与守旧互相水火,臣以为理无两可,事无中立,非定国是无以示臣民之趋向;非明赏罚无以为政事之推行……古今为政,未有东西未定,游移两可者。臣愚谓皇上,仍主守旧则已。若审观时变,必当变法。非明降谕旨,著定国是,宣布维新之意,痛斥守旧之弊,无以定趋向,而革旧俗也。光绪帝根据此折,终于定下决心,向全国臣民下诏宣布变法。
光绪二十四年(公元1898年)6月11日,光绪帝颁布《定国是诏》,决定变法。从此,杨深秀更是身体力行地投身于维新变法运动。在风云激荡的百日维新期间,面对守旧派对变法的阻挠,杨深秀劾礼部尚书怀塔布、许应马癸,光绪遂将怀塔布等革职;守旧派要劾维新人士湖南巡抚陈宝箴,杨深秀又奋起为之抗疏剖白。
杨深秀每在变法的关键时刻,或单独上折,或联合他人上折,提出指导性的政策建议、方法或步骤等。这些建议多为皇帝采纳,转成上谕颁行。在百余天的时间里,杨深秀或单独上折,或与他人联名上折,共上奏折达17件之多。新政实施主要内容有:改革政府机构,裁撤冗官,任用维新人士;鼓励私人兴办工矿企业;开办新式学堂吸引人才,翻译西方书籍,传播新思想;科举考试废除八股文,取消多余的衙门和无用的官职。但因变法损害到以慈禧太后为首的守旧派的利益而遭到强烈抵制与反对。
面对无边的阴霾,维新派将改良图强的大志,再一次上书给光绪皇帝,但昏聩的当权者慈禧不仅蔑视,而且百般阻拦,她害怕失去荣华富贵,害怕变法成功要了她的脑袋。面对强敌阻挠,维新志士没有被吓到,他们没有在失望中消沉,更没有在困难前退缩。
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